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ヒトデの卵成熟と初期発生(受精・卵割)の観察

ヒトデの初期発生を観察する。

実験のねらいと特徴

ヒトデの卵成熟、受精、卵割を観察することで、『生物の初期発生過程のダイナミクス』を体験させる。

実験の流れ

  1. 準備
    1. 材料、試薬、器具の準備
    2. 限られた実験時間内に卵割過程を観察できるように、一部の卵を受精させておく。 詳細は
    3. 『イトマキヒトデ受精法』
  2. 前説明
    1. 棘皮動物ヒトデについて
    2. 減数分裂、受精、細胞分裂について
    3. スケッチの意義と描き方について
    4. 明視野顕微鏡の使い方について
  3. 実験中
    1. ヒトデの卵成熟・受精・卵割過程の観察(レンズに海水が付かないように留意させる)。
  4. 実験後
    1. レポート作成と提出
    2. 顕微鏡のレンズとステージの掃除

はじめに

多くの生物は、卵と精子を介した有性生殖により新たな個体を作り出す。卵と精子は、遺伝子のセット(ゲノム)を一揃いのみ持つ生殖細胞である(図1)。 精子が卵と融合し受精が成立した卵は、受精卵と呼ばれる。受精卵は分裂を繰り返すことで、細胞数を増やし、個体へと発生していく。私たちヒトにおいては、 一個の受精卵から60兆個まで細胞が増殖する。各細胞は、ゲノム情報に基づき、形と機能を特異的に変化させ始め(細胞分化)、相互に作用し合うことで(細 胞間相互作用)、それぞれの細胞が3次元的に構築された組織、器官を形成し(形態形成)、最終的に種に固有の形を作り出す。発生過程は、単相(n)の生殖 細胞から複相(2n)の体細胞、さらに、組織、器官、個体へと階層が上る過程と特徴づけることができる。階層が上るに従って生物は複雑な構造を形成し、よ り高次の機能を獲得する。

(lightboxで画像ウインドウが開きます)図1.卵と精子の形成過程における核相 および倍数性 の変化

図1.卵と精子の形成過程における核相 および倍数性 の変化

発生プログラムは、受精卵のゲノムに書き込まれており、世代を超えて正確に引き継がれる。すなわち、カエルの受精卵はカエルに、ヒトデの受精卵はヒトデに なる。発生の各過程では、受精卵と同じ遺伝情報を持つ細胞たちが、位置と時を間違えずに多様な遺伝子を発現する。その中でも、発生の初期過程は、受精に向 けて卵が成熟し、受精が成立した後、胚を構築する細胞の数が急速に増える時期である。これらの変化を顕微鏡下でじかに観察することをとおして、刻一刻と変 化する発生の初期過程のダイナミクスを体験する。

目的と課題

(目的1) ヒトデ卵成熟の観察
  • 課題1:卵核胞(germinal vesicle; GV)を有する未成熟卵を観察・スケッチする。
  • 課題2:未成熟卵を1-メチルアデニン(1-methyladenine;1-MA)で処理し、GVが崩壊して成熟卵となる過程を観察し、成熟卵をスケッチする。
(目的2) 受精の観察
  • 課題3:受精膜の形成、および第1、第2極体の放出を観察し、受精卵をスケッチする。
(目的3) 卵割の観察
  • 課題4:2細胞期、4細胞期の胚、ならびに細胞質分裂を進行している状態の胚をスケッチする。媒精からの経過時間も記録する。
(目的4) 精子の観察
  • 課題5:ヒトデに特徴的な精子の頭部と尾部をスケッチする。

実験

材料

イトマキヒトデ(Asterina pectinifera)の卵:
未成熟卵(1シャーレ/8人)、サンプル1(1シャーレ/1人)、サンプル2(1シャーレ/1人)
イトマキヒトデ(Asterina pectinifera)の精子懸濁液:
受精用と観察用(試験管2本/8人)

試薬

1mM1-メチルアデニン (1-MA;C6H7N5,MW=149.2):10μl/10 mlの海水中に入れた卵巣
海水、または人工海水(マリンアート):200 ml/8人

器具

光学顕微鏡(1台/1人)
直径6cmシャーレ(ヒトデ卵観察用)(2枚/1人)(サンプル1、サンプル2を入れて配布)
パスツールピペット(3本/8人)
ビニールテープ付きスライドガラス(1枚/1人)
スライドガラス(1枚/1人)
カバーガラス (2枚/1人)
濾紙片 (適宜)

手順

1. 卵成熟(図4参照) 

 i. 1-メチルアデニン(1-MA)処理していない卵巣片から、卵をスペーサー付き観察用スライドガラス(図2)上にとり、カバーガラスをかけて、濾紙で余分な海水を吸い取り、100倍で顕鏡・スケッチする(注1)。

(lightboxで画像ウインドウが開きます)図2.スペーサー付き観察用スライドガラス

図2.スペーサー付き観察用スライドガラス

 ii. 15分前に1-メチルアデニン(1-MA)処理された卵巣片から得た卵(サンプル1)(図3)を、10倍の対物レンズを使ってシャーレ中で顕鏡し、GVが崩壊していく様子を観察する(注2)。顕微鏡のステージが、メカニカルステージの場合には、クレンメルで挟んだスライドガラスの上にシャーレを乗せて顕鏡することで、シャーレ中の観察位置をスムーズに変えることができる(注3)。

(lightboxで画像ウインドウが開きます)図3.ヒトデ卵成熟と初期発生のタイムスケジュール(19℃)(注8)

図3.ヒトデ卵成熟と初期発生のタイムスケジュール(19℃)(注8)

2. 極体形成・受精(図4参照)

  1. GVが崩壊したサンプル1のシャーレ中の卵細胞に、精子液を1滴加える。加えた時間をすぐに記録する。
  2. シャーレを静かに揺すって精子を撹拌し、その後に生じる受精膜、第一極体、第二極体の形成を10倍の対物レンズを使ってシャーレ中で速やかに観察する(注4)。
  3. 各スケッチには、媒精からの経過時間を必ず記録する(注5)。

 3. 卵割(図4参照)

  1. 30分前に媒精した卵巣片から得た卵(サンプル2)(図3)を、スペーサー付き観察用スライドガラス上にとり、カバーガラスをかけ、濾紙で余分な海水を吸い取り、100倍で顕鏡する。
  2. 2細胞期、4細胞期の胚を観察する。また、細胞質がくびれて、2細胞または4細胞になる過程(細胞質分裂中の様子)も観察する。各スケッチには、媒精からの経過時間を必ず記録する。

(lightboxで画像ウインドウが開きます)図4.イトマキヒトデの卵成熟と初期発生

図4.イトマキヒトデの卵成熟と初期発生

 4. 精子(図5参照)

  1. 通常のスライドガラス上に精子液を1滴落とす。
  2. カバーガラスをかけ、余分な海水を濾紙で吸い取り、600倍(対物レンズ40倍×接眼レンズ15倍)で顕鏡する(注6)。コンデンサーのフィルター上に遮光板を入れることで、簡易的な暗視野照明が可能になり、精子の頭部や尾部の形態が明瞭に観察できる(注7)。
     

(lightboxで画像ウインドウが開きます)図5.イトマキヒトデの精子(微分干渉像)

図5.イトマキヒトデの精子(微分干渉像)

ポイントやトラブルシューティング

注1:卵がつぶれないように、ビニールテープで隙間を作ったスペーサー付きスライドガラスで観察する。
注2: シャーレのままの顕鏡では、対物レンズは10倍までにすること。レンズに海水がつかないようにくれぐれも注意する。海水がついた場合は、速やかにスタッフ に伝え、レンズが腐食しないように丁寧にクリーニングする。(海水のついた部分を蒸留水で洗い、レンズペーパーを用いて、水分を完全に拭き取る)
注3:クレンメルがスムーズに作動するように、スライドガラス裏面に水がつかないように注意する。
注4:媒精約1分後に受精膜の上昇、続いて約15分後に第一、第二極体形成が生じる。比較的に速い現象であるので、見落とさないように注意する。
注5:経過時間は時刻ではなく、媒精からの正味の時間を記述する。
注6:精子の観察は、通常のスライドガラスでおこなう。ビニールテープで隙間を作ったスライドガラスでは、精子が泳ぎ回って、観察しづらい。
注7:開口数が比較的小さな0.05~0.6ぐらいの対物レンズを使用している場合は、適切な大きさの遮光板(例えば10円玉やレンズの大きさに合わせた黒っぽい紙)をコンデンサーレンズ上に乗せることにより、簡易暗視野照明が得られる。
注8:1℃の温度上昇でも、発生は速く進行するのでタイムスケールはあくまでも目安とし、注意して観察する。
「顕微鏡の使い方」をよく読む。生きている細胞を観察しているので、光源の熱による水分の蒸発や温度上昇は、最小限になるようにくれぐれも注意する。

実験を成功させるための留意点

実験前

必要量のイトマキヒトデを用意し、タイムスケージュール(図3)に従って、1-MA処理や媒精を行う。余裕があれば、媒精の時間を15分程度ずらしたサンプルをいくつか用意するとよい。
未受精卵を扱うピペットは、精子を扱うピペットとしっかり区別し、誤って、未受精卵に精子が混ざらないようにする。

実験中

海水をレンズに付着させないよう注意を促す。

実験後

顕微鏡本体とレンズに海水がついていないか確認させる。

本実験の発展

『ヒトデの受精・形態形成におけるカルシウムイオンの役割』や『ヒトデの発生過程の観察』と組み合わせることができる。

資料

参考映像