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イトマキヒトデの受精法

はじめに

イトマキヒトデの受精法を1. 精子の単離2. 卵の単離3. 受精の3項目に分けて記述する。

材料

  • イトマキヒトデ(Asterina pectinifera

試薬

  • 1 mM 1-methyladenine:分子量149.15
     
    1 mM 1-methyladenine 溶液 100 ml
    1-methyladenine 15 mg
    蒸留水 100 ml
  • 海水、または人口海水(マリンアートMARINEART®SF-1)300~500ml程度

器具

  • ハサミ 
  • ピンセット 
  • パスツールピペット 
  • ビーカー 
  • 直径9cmガラスシャーレ 
  • 15ml試験管 
  • 手回し遠心機 

手順

  1. イトマキヒトデの精子の単離
    1. オスのヒトデの腕の外皮にハサミを入れ、ピンセットで挟みだすようにして精巣を取り出す。
      (ヒトデは、雌雄異体で、その生殖巣は各腕の体腔に1対ずつ存在する。)
    2. 3 mlの海水が入った試験管に、取り出した精巣の一部を入れる。
    3. ii の海水をパスツールピペットで懸濁することで、精子を海水中に遊離させる。
       
  2. イトマキヒトデの卵の単離
    1. メスのヒトデの腕にハサミを入れ、オスの精巣と同様に卵巣を取りだす。
    2. 2腕分の卵巣を10 mlの海水が入った50mlビーカーに入れる。
    3. 上清が濁っていた場合、上清を捨て新たな海水に変える。(注1)
    4. iii のビーカーに1 mM 1-methyladenineを10 µl加え、良く攪拌し、15-20分処理する。
    5. 海水が入った9cmシャーレに卵巣をピンセットで移し、ハサミを用いて細かく切断する。
    6. 卵巣から出てきた卵を観察し、卵核胞がなくなっている事をチェックする。
    7. 卵懸濁液を試験管に移し、手回し遠心機を用いて卵を集める。
    8. vii の上清を捨て、新たな海水10 mlで未受精卵を懸濁した後、500mlビーカーに移す。
       
  3. 受精法
    1. 1. の作業で得た精子数滴(1-4滴)を 2.で準備した未受精卵懸濁液に加え、よく攪拌する。
    2. 受精膜を確認した後、未授精卵の体積1mlあたり(注2)、200-300mlの海水を加えて懸濁し、攪拌培養する(20 ℃, 30 rpm)。
    3. 20℃の温度条件で、64細胞期は4時間、胞胚は16時間、中期原腸胚は24時間、後期原腸胚は36時間、ビピンナリア幼生は60時間インキュベートすると、目的の発生ステージのサンプルが得られる。

ポイントやトラブルシューティング

  • 注1:濁ったまま作業を進めると、発生がうまく進まないことがあるので、濁った場合は、かならず海水を入れ替える。
  • 注2:本作業を実施するにあたっては、卵巣が充分に成熟した親個体を準備する必要がある。具体的には、5~7月は東京湾、9~12月は青森県陸奥湾産のイトマキヒトデが実験に使用できる。

印刷用PDFマニュアル

イトマキヒトデの受精法  pdf (211KB)

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